ศาลายาเดิมเป็นหมู่บ้านเล็ก ๆ อยู่ในมณฑลนครชัยศรี ไม่มีหลักฐานการตั้งถิ่นฐานชุมชน จนกระทั้งช่วงต้นกรุงรัตนโกสินทร์ที่เริ่มมีการบันทึกเกี่ยวกับชุมชนในย่านนี้ ซึ่งเป็นเส้นทางการเดินทางจากพระนครไปยังเมืองต่าง ๆ ทางตะวันตก เช่น นครปฐม ราชบุรี สุพรรณบุรี และกาญจนบุรี เนื่องจากเป็นเส้นทางสัญจรทางน้ำที่เชื่อมต่อแม่น้ำเจ้าพระยากับแม่น้ำท่าจีน โดยแต่เดิมใช้คลองโยงเป็นเส้นทางสัญจรหลัก ดังที่ปรากฎในนิราศพระประธมของสุนทรภู่ และนิราศของกวีในสมัยนั้นอีกหลายท่าน ที่เดินทางไปนมัสการพระปฐมเจดีย์หลังจากที่ พระวชิรญาณภิกขุ (ร.4) ทรงค้นพบ และเดินทางไปยังเมืองต่าง ๆ ดังที่กล่าวมาแล้ว ต่อมาเมื่อพระบาทสมเด็จพระจอมเกล้าเจ้าอยู่หัวทรงครองราชย์แล้ว จึงได้มีการขุดคลองเจดีย์บูชา และคลองมหาสวัสดีขึ้น เพื่อความสะดวกสบายในการเสด็จพระราชดำเนินไปทรงนมัสการพระปฐมเจดีย์ โดยมีเจ้าพระยาทิพากรวงศ์ (ขำ บุนนาค) เป็นแม่กองในการขุดคลอง เมื่อขุดคลองเสร็จแล้วได้มีการสร้างศาลาริมคลองในทุก ๆ 100 เส้น รวมได้ 7 ศาลา ซึ่งแต่เดิมเรียกตามลำดับศาลา ได้แก่ ศาลาหนึ่ง ศาลาสอง ศาลาสาม ศาลากลาง ศาลาห้า ศาลาหก และศาลาเจ็ด ตามหลังฐานจากนิราศพระปฐม ของหลวงจักรปาณี (ฤกษ์) ซึ่งต่อมาสมเด็จพระเจ้าบรมวงศ์เธอ กรมพระยาดำรงราชานุภาพ ได้ทรงบันทึกไว้ว่า เจ้าพระยาทิพากรวงศ์ได้สั่งให้เขียนตำรายารักษาโรคต่าง ๆ ใส่แผ่นกระดานไว้เป็นการกุศล คนจึงเรียกศาลานี้ว่า “ศาลายา” และอีกศาลาที่สร้างเจ้าพระยาทิพากรวงศ์สร้างขึ้นเพื่อเพื่อปลงศพคนของท่านที่เสียชีวิตระหว่างการขุดคลอง จึงเรียกศาลายานั้นว่า “ศาลาทำศพ” (ต่อมาเปลี่ยนชื่อเป็น “ศาลาธรรมสพน์” ในปัจจุบัน)
นอกจากนั้นพื้นที่โดยรอบคลองมหาสวัสดีนั้น ยังเป็นที่นาหลวงที่พระบาทสมเด็จพระจอมเกล้าเจ้าอยู่หัวทรงจับจองที่ดินไว้สำหรับเป็นพระราชมรดกพระราชทานพระราชโอรสพระราชธิดาทุกพระองค์ ซึ่งพื้นที่ของมหาวิทยาลัยมหิดล ศาลายา เป็นส่วนหนึ่งของที่ดินพระราชมรดกในส่วนของพระบาทสมเด็จพระจุลจอมเกล้าเจ้าอยู่หัว สืบทอดต่อมายังพระบาทสมเด็จพระเจ้าอยู่หัวรัชกาลต่อมา โดยมีสำนักงานทรัพย์สินส่วนพระมหากษัตริย์เป็นผู้ดูแล โดยในปี พ.ศ. 2514 พระบาทสมเด็จพระเจ้าอยู่หัว รัชกาลที่ 9 ได้ทรงพระกรุณาโปรดเกล้าโปรดกระหม่อมให้สำนักงานทรัพย์สินส่วนพระมหากษัตริย์ ขายที่ดินในส่วนนี้จำนวน 1,242 ไร่ 20 ตารางวา เพื่อใช้เป็นสถานที่ตั้งของมหาวิทยาลัยมหิดลสืบมาจนถึงปัจจุบัน
และถ้าสืบขึ้นไปอีก พื้นที่จังหวัดนครปฐมนั้นเป็นที่ตั้งของอาณาจักรทวารวดี ที่เป็นชุมชนโบราณที่เป็นย่านการค้าเมื่อประมาณ 1,000 ปีก่อน อีกด้วย
จากประวัติศาสตร์ที่ยาวนานของพื้นที่ ทำให้มีตำนานของวิญญาณที่สิงสถิตอยู่ในพื้นที่ศาลายา โดยเฉพาะที่ดินแปลงใหญ่ อันเป็นที่ตั้งของมหาวิทยาลัยมหิดลอยู่ถึง 3 ยุค ด้วยกัน ยุคแรกคือวิญญาณของคนโบราณในสมัยทวารวดี เชื่อกันว่าเป็นผีแขก ยุคที่สอง เชื่อว่าเป็นดวงวิญญาณของผู้ที่เสียชีวิตจากโรคระบาดในสมัยกรุงรัตนโกสินทร์ ช่วงรัชกาลที่ 2 และยุคที่ 3 คือดวงวิญญาณที่เสียชีวิตในยุคปัจจุบัน รวมถึงวิญญาณของอาจารย์ใหญ่ใช้ในการศึกษาวิชากายวิภาคด้วย การที่มีวิญญาณถึง 3 ยุค ที่สิงสถิตอยู่ในพื้นที่ศาลายา จึงทำให้เกิดตำนานต่าง ๆ ในมหาวิทยาลัยมหิดลขึ้นตามมา